Citrobacter sp. 降解火炸藥類物質三硝基甲苯(Trinitrotoluene)之作用機制和固定化關鍵降解酵素與其應用之研究(3/3)

土壤及地下水被火炸藥類物質污染是一個長久以來被嚴重 忽視的問題。由於部分火炸藥類物質三硝基甲苯 (trinitrotoluene (TNT))已確定或可能具致癌性。本計畫之主要目的即是針對火炸藥類物質污染場址中最具代表性之TNT為目標污染物，探討自高雄市汙染TNT土壤分離出Citrobacter sp.，然後將此菌應用於TNT之生物復育之可行性評估，以達到綠色整治之目的。進一步利用系統生物學方法 (功能性基因體和蛋白質體法)，尋找相關重要降解基因/蛋白質和生物反應性基因/蛋白質，決定此菌降解TNT分子機制，可提供未來如何強化此菌對TNT降解重要策略參考。故擬訂三年計劃如下: 第一年建立Citrobacter sp.降解TNT之最佳培養條件、最大容忍濃度、環境因子對降解之影響及好/氧條件下代謝副產物之種類。最後，以生物反應器建立模擬汙染TNT模場，評估Citrobacter sp.降解TNT之能力。接著第二年，針對Citrobacter sp.結合RNA-seq方法 ，研討Citrobacter sp.全基因體定序及在菌種經TNT處理前後，進行其功能性基因體分析所有有表現量差異之基因 (> or = 2 or <2, p<0.05)，利用生物資訊分析者這些表現量有差異基因，可推測菌種降解TNT之可能分子機制。除此之外，RNA-seq結果對於相關降解基因或相關重要生物反應性基因，具有表現量差異基因均以既時定量 PCR 驗證這些基因表現量是否符合RNA-seq結果。第三年進行Citrobacter sp.降解TNT前後之蛋白質體之系統性分析，再結合第二年所獲得功能性基因體數據比較分析後，找出主要作用TNT 之酵素。將此酵素以分子生物法大量表現此酵素，然後純化此酵素。進一步探討主要降解酵素之最適反應酸鹼值與溫度、酵素動力、基質專一性等多種特性;並整合酵素固定化技術以開發具有高處理效率之TNT生物技術整治方法，本計劃整合微生物學，基因體學，蛋白質體學和生物資訊學應用在生物復育研究，此研究獲得數據，未來可擬定如何加強菌種生物復育能力策略參考，以及針對在汙染環境中許多變數 (如pH，溫度等)，可調控相關降解或重要生物反應性基因或蛋白質表現量，使菌種生長和降解能力表現最佳化。 再者，本計劃所使用分子生物方法特點具有高效率和全面性，可檢測所有基因和蛋白質表現。且基因體和蛋白質體同時